Антивоспалительное действие Propionibacterium acnes. Часть 1

«Эстетический Гид» публикует перевод первой части научной статьи ученой группы в составе:

• Янхан Ван (Yanhan Wang), Тиссы Р. Хата (Tissa R. Hata), Юн Ларри Тонга (Yun Larry Tong), Ричарда Л. Галло (Richard L. Gallo) с кафедры дерматологии медицинского факультета Университета Калифорнии (США),
• Мин-Шан Као (Ming-Shan Kao) с кафедры биомедицинских наук и инженерии Национального Центрального Университета (Чжунли, Тайвань),
• Кристоса С. Зубулиса (Christos C. Zouboulis) с кафедры дерматологии, венерологии, аллергологии и иммунологии Медицинского центра Дессау при Бранденбургской Медицинской Школе Теодора Фонтане (Германия),
• Чуна-Ми Хуан (Chun-Ming Huang), работающей в исследовательских центрах Калифорнии и Чжунли.

Статья посвящена Пропионовой бактерии акне, ее способности бороться с самой угревой сыпью, а также выступать в качестве профилактического средства.
  
Кроме того, из данной статьи вы узнаете о том, что такое фактор CAMP и как он влияет на воспалительные процессы.

Желаем вам приятного и полезного чтения!

От воспалительных acne vulgaris страдают сотни миллионов людей по всему миру. Propionibacterium Acnes, условно-патогенную бактерию кожи, связывают с патогенезом угревой болезни.

Результаты нашего исследования показывают, что секреторный фактор Christie-Atkins-Munch-Petersen (CAMP) пропионовой бактерии акне (дальше - P. acnes) активируется в анаэробных культурах.

Мутация фактора CAMP значительно уменьшает колонизацию P. acnes и воспаление у мышей, демонстрируя существенную роль фактора CAMP в цитотоксичности P. acnes.

Вакцинация мышей фактором CAMP значительно снижала рост P. acnes и продуцирование MIP-2, мышиного аналога человеческого IL-8.

Также очаги акне были забраны у пациентов с целью установить модель акне ex vivo для подтверждения эффективности антител фактора CAMP при нейтрализации воспалительного ответа угревой сыпи.

Фактор CAMP бактерий P. acnes и два провоспалительных цитокина (IL-8 и IL-1β) были экспрессированы на более высоких уровнях поражения акне, чем у кожи без очагов сыпи.

Инкубация эксплантатов акне ex vivo с моноклональными к CAMP-фактору антителами заметно ослабляла количество IL-8 и IL-1β.

Наша работа с использованием модели acne ex vivo показывает, что фактор CAMP бактерий P. acnes является основным источником воспаления в acne vulgaris.

Аббревиатуры:

• CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen, Кристи-Аткинс-Мунк-Петерсен);
• МАТ (моноклональное антитело);
• ТФР (трансформирующий фактор роста;
• Тх (клетка Т-хелпер).

Введение

Propionibacterium acnes, теперь также известная как Cutibacterium acnes в связи с новой таксономической классификацией (Boisrenoult, 2018), представляет собой грамположительную условно-патогенную бактерию кожи и преобладает (>60% от общего количества бактерий) на коже лица у людей (Griceet al., 2009).

P. acnes есть почти у каждого из нас (Ahnet al., 1996, BrookandFrazier, 1991), а она составляет почти половину всего микробиома кожи (Tancrede, 1992) с оцененной плотностью от 102 до 105–6 см2 (Leydenet al., 1998, McGinleyet al., 1978).

Избыточный рост бактерии P. acnes связан с acne vulgaris, кожным заболеванием, поражающим более 85% подростков и более 40 миллионов человек в одних только Соединенных Штатах (FriedandWechsler, 2006, Tagliettiet al., 2008, White, 1998).

Современные методы лечения акне часто являются неполноценными или труднопереносимыми, но многие варианты нацелены на сам микроорганизм P. acnes, который участвует в генезе воспаления акне (DessiniotiandKatsambas, 2010, Leyden, 2001).

Так, мы использовали метод вакцинации, чтобы проверить, является ли фактор CAMP бактерий P. acnes, секреторный фактор вирулентности (Valanneet al., 2005), основным причиной воспаления acne vulgaris.
В геноме P. Acnes были обнаружены пять генов с приблизительно 32%-ной гомологией последовательностей к когемолитическому фактору Streptococcus Agalactiae CAMP (Bruggemann, 2005).

Фактор CAMP бактерий P. acnes способен связываться с классами иммуноглобулина G и M и действовать как порообразующий токсин (Valanneet al., 2005). Данные предыдущих исследований в нашей лаборатории показали, что фактор CAMP в сочетании со сфингомиелиназой запускает когемолитическую активность, которая может придать цитотоксичность как кератиноцитам, так и макрофагам (Nakatsujiet al., 2011), усиливая вирулентность путем деградации и вторжения в клетки-хозяева.

Кроме того, фактор CAMP бактерий P. acnes может спровоцировать гибель клеток себоцитов в сальных железах и вызвать воспаление (Liuet al., 2011).

Вдобавок есть доказательства того, что P. Acnes воздействует на клетки кожи, а именно кератиноциты и фагоцитарные клетки (макрофаги), которые стимулируют клетки для продуцирования провоспалительных цитокинов (в том числе, IL-8, IL-1β, IL-12 и фактор некроза опухолей α), что приводит к воспалению acnevulgaris (ContassotandFrench, 2014, Kurokawaet al., 2009, Nagyet al., 2006, Nakatsujiet al., 2011, Qinet al., 2014).

Прием антибиотиков при лечении акне чреват развитием резистентных бактерий и не позволяет нейтрализовать секреторные токсины. Изотретиноин, 13-цис-ретиноевая кислота, считается основным средством для системного лечения тяжелой формы акне (Laytonet al., 2006).

Однако изотретиноин может спровоцировать депрессию и повысить вероятность появления врожденных дефектов плода, если принимать его во время беременности (Mondalet al., 2017). Препарат контролируется Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.

Несмотря на эффективность изотретиноина при лечении угревой болезни, все еще нет эффективного способа воздействия, который мог бы предотвратить появление акне.

Ранее нами уже было доказано, что вакцинация предотвращает воспаление, вызванное фактором CAMP бактерий P. acnes (Huanget al., 2008, KaoandHuang, 2009, Liuet al., 2011, Loet al., 2011, Nakatsujiet al., 2008a, Nakatsujiet al., 2008b, Nakatsujiet al., 2008c, Nakatsujiet al., 2008d, Nakatsujiet al., 2011).

В выводах наших предыдущих публикаций показано, что вакцинация с использованием поверхностной сиалидазы (Nakatsujiet al., 2008b) или убитой при нагреве P. acnes (Nakatsujiet al., 2008a) в качестве антигена значительно подавляла воспаление, вызванное P. acnes.

В частности, у привитых мышей наблюдалось снижение припухлости ушей и продуцирования MIP-2. В этом случае мы исследовали использование специфического секреторного фактора вирулентности в качестве вакцины, поскольку уже имелись данные о том, что специфическое ингибирование секреторных факторов вирулентности представляет собой меньшее избирательное давление для развития резистентных бактерий (Raskoet al., 2008).

Ранее мы показали, что фактор CAMP бактерии P. acnes является иммуногенным и секреторным токсином (Nakatsujiet al., 2011), и что вакцинация мышей с гиперэкспрессирующим фактором CAMP Escherichiacoli обеспечивает терапевтическую защиту от P. acnes (Liuet al., 2011, Loet al., 2011, Nakatsujiet al., 2011).

С целью разработки терапевтических инъекционных подходов для лечения акне в будущем мы решили дополнительно выявить взаимосвязь P. acnes у людей.

Эти эксперименты включали вакцинацию клиническим алюминиевым адъювантом, статус P. acnes как комменсальной бактерии у людей и оценку эффективности антителфактора CAMP с использованием эксплантовак не человека ex vivo.

Результаты

P. acnes - это анаэробный микроб, эндемичный для человека. Геном P. acnes выявил гены для многих факторов вирулентности, связанных с деградацией тканей и генов хозяина, участвующих в индукции воспаления (Bruggemann, 2005, Schaeferet al., 1980).

Доказано, что производство факторов вирулентности P. acnes заметно увеличилось в отсутствие кислорода (Coveet al., 1983). Эти факторы вирулентности, либо секретирующиеся из P. acnes, либо закрепленные в клеточной стенке, стимулируют смежные клетки-хозяева и вызывают воспаление и повреждение клеток. Чтобы выявить факторы вирулентности, которые активно экспрессируются в анаэробных условиях, был проведен количественный протеомический анализ P. Acnes с кислородом и без него.

Изменения в насыщенности отдельными видами белка у P. acnes, выращенными в аэробных и анаэробных условиях, были проанализированы с использованием метода изотопного кодирования белковых меток на негелевой основе (Schmidtet al., 2005).

В общей сложности были секвенированы 342 белка методом нано-жидкостной хроматографии линейной ионной ловушки квадрупольной тандемной масс-спектрометрии.
  
23 белка из списка были идентифицированы как белки с повышенным или пониженным уровнем экспрессии в анаэробных или аэробных условиях (см. на Journal of Investigative Dermatology)

По количественному определению внутреннего пептида DLLKAAFDLR фактора CAMP (номер доступа: WP_002518322) мы обнаружили, что анаэробная культура привела к 1,5-кратному увеличению экспрессии фактора CAMP (рисунок 1a). Внутренний пептид был секвенирован, он представлен на рисунке. 1b.

Рисунок 1

Активация фактора CAMP бактерии Propionibacterium acnes в анаэробных условиях и важная роль фактора CAMP в индуцированном P. Acnes провоспалительном цитокине MIP-2 и бактериальной колонизации. (a) Бактерия P. Acnes ATCC 6919 была выращена в аэробных и анаэробных условиях. Лизаты (1 мг) P. acnes (ATCC 6919) аэробного и анаэробного происхождения были помечены 12C6-Nic-NHS и 13C6-Nic-NHS, соответственно.

После смешивания образцов с пометками 12C6-Nic-NHS и 13C6-Nic-NHS, смесь подвергали масс-спектрометру LC-LTQ.

В результате был продемонстрирован фактор CAMP с разностью масс 3 Da на помеченную область в масс-спектрах. (b) Пептид DLLKAAFDLR был секвенирован и обозначен как внутренний пептид фактора CAMP. (c)

Правые уши подопытных мышей в Институте Исследований злокачественных опухолей (Лондон, Великобритания) проинъецировали интрадермально штаммом немутантного типа фактора CAMP мутирующей бактерии P. acnes (Δcamp2) (107 КОЕ в 20 микролитрах фосфатно-солевого буфера).

Инъекция 20 мкл ФСБ в левые уши служила проверочным элементом. (d) Через три дня после инъекции провоспалительные цитокины MIP-2 количественно определялись при помощи анализа ELISA. (e, f).

Бактериальные колонии (КОЕ) были пронумерованы путем посева последовательного разведения (1:101–1:105) ушного гомогената на агаровой пластине. Планки погрешностей представляют собой ± стандартное отклонениев количестве пяти мышей. * P<0,05, *** P<0,001 по t-критерию Стьюдента.

Пояснения:

• CAMP - Кристи-Аткинс-Мунк-Петерсен;
• КОЕ - колониеобразующие единицы;
• LC-LTQ, жидкостно-хроматографическая линейная ионная ловушка квадруполя;
• Nic-NHS, N-никотиноилоксисукцинимид.

Важная роль фактора CAMP в воспалении, вызванном P. acnes

Хотя результаты исследования, описанного в нашей предыдущей публикации (Huanget al., 2008) показали, что сыворотка крови мышей, привитых фактором CAMP, смогла нейтрализовать вирулентность фактора CAMP, нокаутный мутант (ΔcAMP) фактора CAMP бактерии P. acnes (Sorensenet al., 2010) использовался для проверки важности роли фактора CAMP при воспалении, вызванном P. acnes.

Сначала мы исследовали рост ΔcAMP invitro. Δcamp и немутантный тип P. acnes (266; 1-1a, ST18) выращивали в усиленной среде для клостридий (BD, Sparks, Baltimore, MD) в 96-луночном микропланшете в анаэробных условиях.

Оптическая плотность 600 считывалась каждый день. Мы обнаружили, что ΔcAMP, как и бактерии P. Acnes немутантного типа имеют одинаковые темпы роста, что указывает на то, что мутация фактора CAMP не влияет на его рост invitro.

Чтобы исследовать существенную роль фактора CAMP в воспалении, вызванном P. acnes, подопытным мышам в Институте Исследований злокачественных опухолей (HarlanLabs, Пласентия, Калифорния) внутрикожно вводили живой ΔcAMP (107 колониеобразующих единиц в 20 мклфосфатно-солевого буфера) или немутантный тип P. acnes.

В качестве проверочного элемента использовали инъекцию того же количества фосфатно-солевого буфера. По сравнению с инъекцией немутантноготипа P. acnes, инъекция ΔcAMP вызывала меньше набухания, покраснения (рис. 1c) и секреции MIP-2 (рисунок 1d) у мышей. Кроме того, в ушах мышей, которым вводили ΔcAMP, наблюдался существенно меньший рост P. acnes, чем при инъекциях немутантного типа P. acnes (рис. 1e и f).

Эти результаты демонстрируют необходимость и участие фактора CAMP в воспалении, вызванном P. acnes.

Выявляемые, но низкие титры антител фактора CAMP у пациентов с акне

Предыдущие результаты исследований показали, что в организме пациентов с акне производится более высокий титр антител бактерий P. acnes, чем у людей без акне (Basalet al., 2004).

Здесь мы привлекли анализ ELISA для определения титра антител фактора CAMP бактерий P. acnes.

Как показано на рис. 2а, титр (1: 400) антитела фактора CAMP у здоровых пациентов был низким, но все же обнаруживаемым, а у пациентов с угревой сыпью титр составил 1: 800.

Чтобы определить, обладают ли антитела фактора CAMP у людей с таким низким титром способностью уменьшать цитотоксичность P. acnes, мышиные макрофагальные клетки RAW264.7 инкубировали с P. acnes ATCC 6919 в сочетании с различными титрами инактивированных сывороток 2,5 %, полученных от здоровых людей и пациентов с акне с титрами антител фактора CAMP 1: 400 и 1: 800.

Клетки также инкубировали с P. acnes в сочетании с инактивированными сыворотками, собранными у мышей, которых предварительно проинъецировали УФ-инактивированной кишечной палочкой, гиперэкспрессируя фактор CAMP титрами антител к нему в диапазоне от 1: 500 до 1: 7 821 500.

Отрицательной контрольной пробой служили клетки, инкубированные с P. acnes, и инактивированные сыворотки, полученные у мышей, привитых УФ-инактивированной кишечной палочкой гиперэкспрессирующего зеленого флуоресцентного белка (GFP).

Как показано на рис.2b, сыворотки человека с титром антитела фактора CAMP 1: 800 не смогли нейтрализовать гибель клеток, индуцированных P. acnes.

Гибель клеток была в значительной степени ингибирована (> 24%) только при использовании мышиной анти-сыворотки фактора САМР с титрами более 1: 62 500, что указывает на то, что низкие титры антител фактора CAMP, продуцируемые у людей, являются недостаточными для снижения цитотоксичности P. acnes.

Рисунок 2

Выявляемые антитела фактора CAMP у пациентов с акне и снижение цитотоксичности Propionibacterium acnes к макрофагам при помощи высоких титров антител, генерируемых в теле мышей, привитых кишечной палочкой, которая гиперэкспрессирует фактор CAMP.

(а) Сыворотки, взятые у людей без акне (нормальный контроль) и пациентов с угревой сыпью (акне) анализировали с помощью ELISA на предмет антител фактора CAMP. Титры антител (IgG) определяли с использованием рекомбинантного фактора CAMP или зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве антигенной ловушки для покрытия 96-луночного планшета ELISA.
  
Конечную точку определяли при разведении сыворотки в лунках, покрытых фактором CAMP, с тем же OD570–450, что и разбавление сыворотки 1/100 в лунках с покрытием GFP. Отрицательный ответ сыворотки при тестировании с наименьшим разбавлением завершались конечными титрами 100.

Данные были представлены как геометрические средние конечные титры ELISA.

(b) Для снижения цитотоксичности P. acnes клетки макрофага RAW264.7 инкубировали с P. acnes ATCC 6919 вместе с различными титрами (как указано) инактивированных сывороток, полученных от пациентов без акне, с акне, а также мышей, привитых кишечной палочкой гиперэкспрессирующего фактора CAMP или GFP в течение 18 часов.

Цитотоксичность P. acnes определяли с помощью анализа ACP и рассчитывали исходя из процента смерти клеток * P <0,05, ** P <0,01 по t-критерию Стьюдента.

Пояснения:

• ACP - кислотная фосфатаза;
• GFP - зеленый флуоресцентный белок;
• OD - оптическая плотность.

Защитный иммунитет против P. acnes, полученный путем вакцинации рекомбинантным фактором CAMP

Подопытным мышам из Института Исследований злокачественных опухолей подкожно вводили рекомбинантный фактор CAMP или зеленый флуоресцентный белок (50 мкг) в качестве антигенов без добавления чужеродных адъювантов, и усиливали эффект таким же количеством антигена через 2 недели после первой вакцинации.

Выработка антитела фактора CAMP было обнаружена с помощью анализа ELISA через 5 недель после первой вакцинации. Антитела фактора CAMP были получены только у мышей, вакцинированных рекомбинантным фактором CAMP при титре примерно 1: 800 000 (рис. 3а).

Результат показал, что фактор CAMP бактерии P. acnes сам по себе является иммуногенным. Однако, в связи с возможностью разработки человеческой вакцины, в качестве адъюванта был выбран алюминий, общий адъювант для применения в медицинских целях (Lindblad, 2004).

С добавлением алюминия рост титров антител фактора CAMP увеличился более чем в 4 раза: речь идет о вакцинах рекомбинантного фактора CAMP (50 мкг) в сочетании с 2%-ным алюминием.

Рисунок 3

Защитный иммунитет у мышей, привитых рекомбинантным фактором CAMP. Ученые Института Исследований злокачественных опухолей дважды подкожно инъецировали мышам 10, 20 или 50 мкг рекомбинантного фактора CAMP или GFP с 2% -ным адъювантом алюминия или без него с интервалом в 2 недели.

(а) Через три недели после вакцинации титр антител фактора CAMP измеряли с помощью ELISA.

(б) Через три недели после второй вакцины GFP- или CAMP-вакцинированным мышам в правые или левые уши, соответственно, интрадермально вводили бактерию Propionibacterium acnes (107 КОЕ в 20 микролитрах фосфатно-солевого буфера) или фосфатно-буферный солевой раствор (20 мкл). Толщина ушей (мм) измерялась через 1 день после инъекции бактерий.

(c) Уровни провоспалительных цитокинов MIP-2 в гомогенатах ушей, вакцинированных P. acnes или фосфатно-буферным солевым раствором, были измерены с помощью ELISA.

(d) Бактериальные колонии (КОЕ) были пронумерованы путем посева последовательного разведения (1:101–1:105) ушного гомогената на агаровой пластине. Планки погрешностей представляют собой ± стандартное отклонение в количестве пяти мышей. * P<0,05, *** P<0,001 по t-критерию Стьюдента.

Пояснения:

• КОЕ – колониеобразующая единица.

Чтобы определить, может ли инъекция фактора CAMP снизить воспаление, вызванное P. acnes, в правое ухо каждой привитой мыши интрадермально вводили 20 мкл P. acnes (107 колониеобразующих единиц), а в левое ухо инъецировали 20 мкл фосфатно-буферного солевого раствора в качестве контрольного элемента (рис. 3b) через 5 недель после первой вакцинации.

По сравнению с мышами, иммунизированными зеленым флуоресцентным белком, у тех мышей, которых прививали только рекомбинантным фактором CAMP без алюминия, наблюдалось уменьшение эритемы, вызванной P. acnes, и утончение ушей (рис. 3b).

Кроме того, вакцинация фактором CAMP сама по себе заметно уменьшала производство провоспалительного цитокина MIP-2 (рис. 3c) и приводила к снижению колонизации P. acnes в коже уха на один log10 (рис. 3d).

Когда титры антител фактора CAMP размножались добавлением 2%-ного алюминия, утончение ушей и снижение выработки MIP-2 (5,109 ± 212,1 до 511 ± 5,9 пг / мл) были намного более выраженными (рис. 3b и c), редукция P. Acnes в коже уха составила уже два log10 (рис. 3d).

Титры антител фактора CAMP у мышей, вакцинированных 10 или 20 мкг рекомбинантного фактора CAMP в сочетании с 2%-ным алюминием, достигали уровней 1: 512 500 и 1: 1 562 500, соответственно (рис. 3a).
  
Если в состав вакцины входил алюминий, инъекция 10 или 20 мкг фактора CAMP - по сравнению с зеленым флуоресцентным белком - обеспечивала эффективную защиту против P. acnes, редуцируя производство цитокина MIP-2 и колонизацию P. acnes в области кожи уха (см. на Journal of Investigative Dermatology).

Эти результаты доказывают, что прививка фактора CAMP бактерии P. Acnes запустила защитную иммунную функцию против P. acnes.

P.S.: Из второй части статьи вы узнаете о присутствии P. acnes в очагах акне и постакне, оценке эффективности моноклонального антитела фактора CAMP в моделях акне ex vivo, а также ознакомитесь с общими результатами исследования.

Совсем скоро на портале «Эстетический Гид», не пропустите!

Источник: Journal of Investigative Dermatology